研究人员提取眼镜蛇毒素以发现膜破坏抗菌肽

对眼镜蛇心脏毒素的计算搜索对 14 种毒液启发的肽进行了结构、抗菌和毒性测试，为人工智能引导的肽发现可以走多远提供了严格的测试。

研究：利用蛇毒心脏毒素发现抗菌肽。图片来源： 库里特·阿夫申 / Shutterstock

该杂志最近的一项研究 NPJ 药物发现 使用计算挖掘、机器学习优先级和实验筛选来识别和评估源自眼镜蛇心脏毒素的候选抗菌肽，以测试受毒素启发的抗菌药物发现途径。

毒液抗菌肽发现的进展与挑战

蛇毒代表了多种生物活性分子的储存库，具有作为抗感染剂的显着前景。毒液衍生的肽和蛋白质经过进化可以破坏猎物和捕食者的细胞和免疫过程，也具有固有的抗菌特性，使其成为药物开发的有希望的模型。然而，依赖于生化分离和功能筛选的传统发现管道受到毒液混合物的复杂性以及与生产更大生物分子相关的挑战的阻碍。

组学技术的最新进展扩大了毒液蛋白质序列数据库，揭示了重要但尚未充分利用的分子多样性。这些数据集通过重述对生物活性至关重要的结构或物理化学基序，使得能够合理设计毒素启发的肽。生物活性肽片段可以编码在更大的毒素序列中，并且仅在释放时才表现出活性。即使有这种潜力，系统性的 计算机模拟 从毒液序列中提取和验证抗菌肽仍然有限。

心脏毒素（环磷酰胺） 从 不 属于三指毒素家族的物种由于其紧凑的尺寸、结构完整性和膜结合特性而特别适合计算肽提取。心脏毒素样碱性蛋白（CLBP）虽然在结构上相关，但在抗菌研究中很大程度上被忽视了。

整合 人工智能 现在，使用毒液可以快速预测抗菌潜力，并确定序列数据中假定的生物活性基序的优先级。然而，将毒素序列挖掘与基于人工智能的肽预测相结合的综合方法尚未得到广泛实施。仍存在关键差距 计算机模拟 蛇毒毒素抗菌肽的鉴定和表征，特别是 CTX 和 CLBP。

CTX 衍生肽的序列分析、设计和功能评估

为了鉴定新的抗菌肽，使用序列挖掘和计算优先顺序选择或设计了 14 种候选肽。 不 （眼镜蛇）心脏毒素/细胞毒素。使用基于机器学习的抗菌肽和溶血肽预测工具对候选肽进行了评估，排除了一些化学修饰的 CTX-p7 计算机模拟 分析。使用固相芴甲氧基羰基合成肽（氟莫克）化学，通过高分辨率液相色谱评估纯度（高效液相色谱法），并通过质谱法确认了它们的分子量（多发性硬化症）。

通过预测 AlphaFold2 蛋白质结构、螺旋轮投影来评估两亲性和圆二色性来评估结构特征。光盘）模拟膜条件下的光谱。使用针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的肉汤微量稀释测定来量化抗菌活性。肉汤微量稀释抗菌剂筛选独立重复三次，每次测定一式三份。通过原子力显微镜研究膜破坏（原子力显微镜）和荧光染色方法。

机制测定包括使用 N-苯基-1-萘胺评估细菌外膜渗透性（NPN) 使用 3,3′-二丙基硫二碳花青碘化物进行细菌内膜的摄取和去极化测定 [DiSC₃(5)] 散文

毒液启发的抗菌肽

探索蛇毒 CTX 作为模型的潜力 AMP 设计，CTX序列 不 从公共蛋白质数据库检索物种并分析序列相似性。序列比较显示高度保守，表明结构和功能基序是保守的。

两种策略指导从 CTX 衍生的候选肽片段的选择，优先使用基于机器学习的 AMP 预测工具。第一个策略包括提取八个特征明确的 CTX 的保守区域，并通过抗菌肽活性（抗菌肽活性）分析这些片段。AMPA) 算法，产生七种天然肽；然后他们设计了 CTX-p5 的另外两种衍生物。第二种方法从 92 个序列中生成了一个一致序列 不 CTX 并用它根据保守氨基酸残基设计了另外五种肽。

AMPA 算法确定了七个假定的抗菌区域。使用抗菌和溶血预测工具进行的进一步评估支持了他们的计算优先级，该策略总共有 9 个肽：7 个源自 CTX 的天然片段，2 个源自 CTX-p5、CTX-p6（增加阳离子性）和 CTX-p7（用于膜相互作用的棕榈酰尾）。基于共识的策略生成了另外 5 种肽 (CTX-p10-CTX-p14)。尽管不同算法的结果有所不同，但大多数肽至少在两个模型中获得了较高的抗菌分数。

计算机模拟 理化分析确定 CTX-p6 和 CTX-p14 最有希望，其次是 CTX-p5 和 CTX-p9，但后来的实验测试确定 CTX-p5 是最有活性的肽。 CTX-p11 具有很高的预测聚集倾向。合成了 14 种肽，HPLC 确认纯度高于 95%，质谱验证预期分子量。

结构分析揭示了 CTX 启发的肽之间存在显着的多样性。 AlphaFold 模型预测了几种的部分螺旋倾向，但其对于短且灵活的序列的可靠性是有限的。 AlphaFold 预测了某些肽的部分折叠或 β-发夹构象，而螺旋轮投影则单独说明了假设理想化 α-螺旋的两亲残基的理论分布。这些理论预测并不总是与实验相符。

CD 谱显示大多数肽在水溶液中无序，但一些肽（包括 CTX-p1、CTX-p8、CTX-p11、CTX-p13 和 CTX-p14）在膜模拟环境中表现出 α-螺旋特征。反卷积证实在这些条件下只有一些采用螺旋结构。只有一部分表现出可诱导的螺旋特征，并且在没有稳定的 α 螺旋的情况下可能会发生膜破裂。氧 安全数据表 e 四氟乙烯 用于诱导结构的条件不能完全复制生物脂质膜。

14 种 CTX 启发肽针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌进行了测试。具有可测量活性的肽具有最低的抑制浓度（MIC）为 125–500 μM，而一些候选药物（主要是基于共识的策略）在高达 500 μM 时没有显示出可测量的活性。 CTX-p5 始终表现出最强的抗菌活性，并被选择用于进一步研究。显微和生化检测支持 CTX-p5 的膜改变作用模式，治疗后通透性和去极化增加。尽管大多数肽都很弱，但 CTX-p5 表现出中等的抗菌和膜溶解活性。

测试了 CTX 启发的肽对人红细胞 (62.5–1000 μM) 的溶血活性。大多数肽在低浓度时很少或不引起溶血，而在高剂量时则具有更大的活性。 CTX-p7 显示出最高的溶血活性，而 CTX-p5 引起的溶血活性要低得多。一般来说，CTX衍生肽通常表现出中度至低度的红细胞毒性。

结论

目前的研究提供了原理证明，即毒素序列挖掘、计算预测和实验验证的整合可以从蛇毒心脏毒素中识别膜活性抗菌肽候选物。

尽管机器学习能够快速确定候选者的优先级，但只有一小部分显示出可测量的抗菌活性，这表明当前预测方法的局限性以及报告弱或不活跃候选者的价值。

与临床先进的抗菌肽相比，所需的抗菌浓度相对较高，这目前限制了这些候选药物作为直接治疗剂的转化价值。这项工作是早期阶段的计算和 体外 研究表明，CTX-p5 需要进一步完善才能被视为治疗先导药物。

将这种方法扩展到其他毒液衍生的分子支持物和靶标可以拓宽生物活性肽疗法的发展。改进的人工智能驱动挖掘、结构预测和实验验证可以帮助完善肽特性，并支持发现针对抗生素耐药病原体的有效和选择性抗菌药物。